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CRISPR/Cas9基因敲除

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR)是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制,其中II型CRISPR/Cas免疫系统依赖Cas9内切酶家族靶向和剪切外源DNA。在这一系统中,crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成双链RNA,此tracrRNA/crRNA二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶定位点剪切双链DNA,其中Cas9的HNH核酸酶结构域剪切互补链,其RuvC-like结构域剪切非互补链。具体如下图所示:

 RNA介导的CRISPR/Cas9剪切系统( Martin et al. Science. 2012 AUG;337)

 

研究表明,CRISPR/Cas9系统能够对小鼠和人类基因组特定基因位点进行精确编辑,这其中包括诱导多能干细胞 iPS等,不仅如此,CRISPR/Cas系统还可以同时针对同一细胞(ES)中的多个位点能实现多靶点同时酶切,人们运用该技术成功获得斑马鱼等模式动物基因敲除模型,使得多个基因敲除、敲入成为可能。

 

作为一种新的基因编辑技术,CRISPR/Cas9有以下特点和优势:

1、靶向精确性更高。RNA靶向序列和基因组序列必须完全匹配,Cas9才会对DNA进行剪切。

2、可实现对靶基因多个位点同时敲除。

3、实验周期短,最快仅需2个月,节省大量时间和成本。

4、无物种限制。

 

我们长期从事小鼠、大鼠基因敲除相关研究,已成功运用CRISPR/Cas9技术获得基因敲除小鼠和基因 Mc3R、基因Mc4R 双基因敲除大鼠。相关文章已在《Nature Biotechnology》上发表: 

Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology 31, 681–683 (2013). http://www.nature.com/nbt/journal/v31/n8/pdf/nbt.2661.pdf

 

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