华东师范大学生命科学学院、生命医学研究所李大力教授团队继2022年10月在国际著名学术期刊 Nature Chemical Biology 报道新一代精准安全的腺嘌呤碱基编辑器ABE9以及11月在国际著名学术期刊 Nature Biotechnology 报道高精度新型胞嘧啶碱基编辑系统Td-BEs后，一年不到又迎来新的技术突破，2023年6月15日该团队再次在 Nature Biotechnology 上发表了题为“Adenine transversion editors enable precise, efficient A•T-to-C•G base editing in mammalian cells and embryos”的研究论文。
该研究报道了一系列新型腺嘌呤颠换编辑工具（AXBEs和ACBEs），并且证明了ACBEs在不同细胞系与小鼠胚胎中的高效性与精确性，其中产生的小鼠疾病模型（A>C平均效率44%-56%）等位基因突变高达100%。AXBEs和ACBEs为多元化的遗传操作和人类第二大类单核苷酸变异（SNVs）的基因治疗提供新的工具。
Nature Biotechnology 刊发华东师大生命科学学院、生命医学研究所李大力教授团队研究成果
人类的遗传疾病主要由基因突变造成，并且约58%为单碱基突变（SNVs）【1】。目前，不依赖DNA双链断裂和模板参与的单碱基编辑器（baseeditors）是治疗遗传病强有力的基因编辑工具。现有的碱基编辑技术CBEs（C-to-T），CGBEs（C-to-G）, GBEs（C-to-G/C-to-A）和ABEs可实现胞嘧啶转换/颠换编辑以及腺嘌呤的转换突变，由于缺少切除肌苷的内源DNA糖苷酶，ABEs的产物纯度可达99%【2-5】。然而，仍有25%的人类单碱基突变遗传疾病需要精准的腺嘌呤颠换编辑（A-to-C或A-to-T）才能纠正，因此开发高效精准的腺嘌呤碱基编辑器具有重要意义。
碱基编辑器介导碱基突变的种类及人类致病性点突变的分布
碱基转换可通过碱基脱氨实现，而碱基颠换则需要依赖无嘌呤无嘧啶（AP）位点的创建，随后进行碱基切除修复途径（BER）而完成。鉴于内源糖苷酶低效的肌苷切除修复能力，华东师大研究人员希望寻找其他可将肌苷作为催化底物的酶，在大多数原核和真核生物中，DNA中的次黄嘌呤是由烷基腺嘌呤DNA糖基化酶或者核酸内切酶V去除，因此研究人员尝试将9种体外具有潜在肌苷切除活性的酶与腺苷脱氨酶TadA-8e和nCas9融合，结果惊喜的发现小鼠来源的烷基腺苷DNA糖苷酶（mAAG）可实现8.7%的A到Y（Y=C或T）的碱基颠换，并且大鼠、枯草芽孢杆菌来源的融合构建体也观察到了一定的腺嘌呤颠换突变。进一步的位置关系测试发现mAAG位于构建体C端的编辑活性最高，因此将其命名为AXBE（X代表任意碱基）。
腺嘌呤碱基颠换原理图以及腺嘌呤颠换编辑器候选者筛选
经过大量内源性靶点评价以及体外酶活实验发现AXBE具有YA*R (R=A或G)碱基背景序列（motif）的偏好性。在含有YAR motif的靶点中，AXBE可产生15-32%的A到Y碱基颠换编辑。AXBE在HeLa细胞系中也可达到高达46%的腺嘌呤碱基颠换。通过Cas9依赖性/非依赖性DNA水平脱靶评估以及转录组水平脱靶检测发现，相比于ABE系统，AXBE的脱靶明显降低，尤其是在RNA水平上降低了90%。
AXBE编辑特性的表征
为增加腺嘌呤颠换编辑效率并拓展靶向范围，基于结构导向的理性设计和筛选鉴定出mAAG中的两个关键突变（mAAG-EF）极大提高对其底物肌苷切除的活性，基于此产生的AXBEv2介导更高效的A到Y编辑，甚至在非YAR-motif位点的颠换突变也显著提升，因此有效改善了颠换编辑的序列背景选择性。此外，mAAG-EF也可以兼容PAM识别更广的其他Cas9变体（如spNG, spRY），表明了可以广泛地靶向基因组，扩大应用范围。
mAAG的分子进化以及AXBEv2编辑特性的表征
虽然AXBEv2展现了高效的A到Y编辑能力(C为主要产物)，但也诱导了严重的非目标碱基A到G突变，于是研究人员希望通过缩窄编辑窗口减少不想要的编辑副产物。腺嘌呤脱氨酶的改造及Cas9嵌入策略的尝试使得A到G的编辑副产物大幅降低，并且A到C的编辑效率还进一步提高，因此该类型编辑器被命名为ACBEs。其中ACBE版本最高可实现45%的A到C编辑以及73%的碱基颠换编辑，而ACBE-Q版本（TadA-8e中引入N108Q突变）相较于ACBE，进一步显著减少了旁观者A到G突变，更加精准地编辑sgRNA的A4-A6位，精确度最高提高了171倍，且只产生背景水平的Cas9非依赖性脱靶事件（平均脱靶效率<0.3%），展现出较高的应用安全性。
ACBEs编辑器的开发及表征
此外，ACBE-Q在小鼠体内也展现出极高的编辑效率和精度。在构建杜氏肌营养不良小鼠疾病模型中，70%突变小鼠（21/30只）实现了靶位点A6到C的编辑，平均编辑效率为56%，A>C编辑纯度最高可达到99.8%。更重要的是,传统的终止密码子产生只能依赖于胞嘧啶的突变，该研究证明了ACBEs可在富含AT的序列背景中基于腺嘌呤引入提前成熟的终止子，通过终止Tyr基因表达成功构建了小鼠白化病模型。最后研究人员评估了ACBEs编辑人类致病性SNVs位点的能力，结果表明ACBE在SH3TC2基因中有效产生63%的终止密码子，该基因的终止会导致腓骨肌萎缩症疾病，通过靶向MYO7A基因，ACBE精准产生与耳聋有关的L618R错义突变。为了研究ACBEs的治疗潜力，研究者构建了携带STAT3c.1145G>T（该热点突变引起复发性传染病）突变的稳转细胞系，ACBEs可以在目标位置引入了想要的A到C纠正编辑。
ACBEs在小鼠体内精确编辑以及在细胞系中模拟或纠正人类致病SNVs
总的来说，该研究通过筛选发现融合小鼠来源的烷基腺苷DNA糖苷酶（mAAG）的腺嘌呤颠换编辑器AXBE可在特定序列中实现腺嘌呤的颠换，进一步的分子进化使得A到Y编辑最高可达73%。AXBEs带来丰富的密码子和氨基酸改变，未来将更适用于分子进化、遗传筛选、谱系示踪等应用。ACBEs能够在AT富集区域提前引入终止密码子扩大了基因调控的范围，并且mAAG与不同Cas变体的兼容性有望进一步扩大A到C的靶向范围，表明了纠正人类第二大类致病性SNVs的治疗前景，另外ACBEs还可以作为独特的工具来探索与胸腺嘧啶相对的特定AP位点如何修复的机制。
华东师范大学生命科学学院博士毕业生陈亮、博士研究生洪梦佳和栾昌明为本论文的共同第一作者，华东师范大学为第一单位，华东师范大学生命科学学院李大力教授为本文通讯作者。麻省理工学院-哈佛大学博德研究所David R. Liu教授团队，华东师范大学生命科学学院刘明耀教授及宋高洁研究员、香港中文大学冯波教授等对本项研究提供了重要支持。该研究受到了科技部重点研发计划、国家自然科学基金以及上海市教委前沿科学基地和重大项目等支持。
附：
论文链接：https://www.nature.com/articles/s41587-023-01821-9
参考文献：
[1] Landrum, M.J. et al. ClinVar: public archive of interpretations of clinically relevant variants.Nucleic Acids Res. 2016, 44: D862-868.
[2] Komor AC, Kim YB, Packer MS, et al. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage.Nature, 2016, 533: 420-424
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[5] Gaudelli NM, Komor AC, Rees HA, et al. Programmable base editing of A·T to G·C in genomic DNA without DNA cleavage.Nature, 2017, 551:464-471.